보고서 설명

1. 제목
The Bradford Method for Protein Quantitation

2. 준비물
⓵ Bradford 시약
⓶ Protein Standard Solution
⓷ Spectrophotometer와 Quartz cuvette, Pipet
⓸ Milk, 증류수
⓹ ep tube
⓺ BSA Protein(standard)

3. 실험 과정
⓵ Milk를 증류수를 이용하여 , , 원액의 비율로 dilution한다.
⓶ Bradford 시약을 1㎖씩 ep tube에 7개 넣는다.
⓷ Standard Soulution을 0㎕, 2㎕, 4㎕, 6㎕씩 tube에 넣는다.
⓸ diluted milk를 5㎕씩 ep tube에 넣는다.
⓹ 거품이 나지 않도록 천천히 뒤집으며 섞는다.
⓺ 각각 시료를 1.5㎖ cuvettes에 1㎖씩 넣는다.
⓻ 7.595㎚ 파장에서 Standard Solution의 흡광도를 측정한 후 기록한다.
⓼ 나머지 시료의 흡광도를 측정한 후 기록한다.

본문일부 및 목차

Bradford Method는 산성 용액에서 불그스름한 갈색을 띄는 Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBBG) 염료의 흡광도 변화를 측정한다. CBBG가 free dye형태로 있을 때의 최대 흡광은 465㎚(빨강)이지만, 단백질의 아미노산과 결합하여 anionic form일 때의 최대 흡광도은 595㎚(파랑)인 점을 이용한다. 595nm에서의 흡광도는 단백질의 농도와 비례하게 된다. CBBG의 음이온이 단백질의 양이온 부분과 정전기적 인력에 의한 결합을 한다. 각각의 Protein 분자에 결합된 CBBG dye의 수는 대략 Protein 에 있는 양이온 수와 비례한다. 단백질에 결합한 CBBG는 용액을 갈색에서 푸른색으로 변하게 한다.
Bradford Method는 매우 빠르고 비용이 낮다는 장점이 있으며, 생체고분자 물질 중 단백질에 매우 특이적이다. 하지만 단백질의 종류, 즉 아미노산의 조성에 따라 반응 정도가 달라지기 때문에 Standard Soulution의 선택이 매우 중요하다. 1시 방해성분으로 알려진 것은 Triton X-100과 황산도데실나트륨(SDS) 이다. CBBG를 사용할 때에는 인산과 메탄올의 혼합물로 된 것을 사용한다. CBBG는 사용 전에 증류수로 5배가량 희석 후 여과 단계를 거쳐 실온에서 보관한다.

5. 결과
⓵ Standard curve

⓶ diluted milk 단백질 농도
1) 비율의 diluted milk : 0.166 = 166
2) 비율의 diluted milk : 1.79 = 1790
3) undiluted milk : 6.986 = 6986

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