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단백질 정량 결과레포트

본문일부 및 목차

4. Material
1) Protein reagent (Bradford reagent)
* 50 ml의 95% 에틸알코올에 100 mg의 Coomassie Brillant Blue G-250을 녹인다.
* 여기에 85% phosphoric acid 100 ml을 넣고 잘 섞는다.
* 증류수를 넣어서 총량이 200 ml이 되게 한다 (이 농축 염색약은 4 ℃에서 약 6개월 동안 보관 가능). 실제 시료에 넣는 염색약은 중류수 4 volume을 넣은 희석 염색약을 사용한다.
2) Protein Standard
* BSA (Bovine Serum Albumin, Sigma)을 농도가 1 mg/ml이 되게 만든다.
3) Spectrophotometer와 Quartz cuvettes.
4) Milk.


5. Method

(1) 시료 만들기
a. Milk를 1, 1/2, 1/4, 1/10, 1/50, 1/100 농도가 되도록 희석한다.
b. 이 때 나머지 볼륨은 DW로 채운다.
c. 이 중에 5μl씩 사용한다.

(2) 기준용액(standard solution)만들기
a. Bradford solution을 total 200μl씩 넣는다.
( 예를 들어 BSA 2μl짜리에는 Bradford 198μl넣기 )
b. BSA 1mg/ml 을 0, 2, 4, 8, 12μl씩 96well-plate에 직접 넣는다.

(3) Bradford와 시료 섞기
a. Bradford solution 495μl를 EP-tube에 넣는다. (시료 수만큼:5개)
b. 1번에서 희석한 각각의 시료 중 5μl을 섞는다.

(4) 시료의 단백질 양 측정하기
a. 96-well plate 뚜껑에 측정할 시료이름을 쓴다. (이때 duplicate으로 실험)
b. 3번에서 만들어 놓은 용액 중에 200μl씩 96-well 중 2개 well에 조심스럽게 넣는다.
( 이 때 너무 파이펫팅 중요! 너무 세게 뿌리면 well밖으로 loss가 생긴다. )

(5) 흡광도 측정하기
a. 595nm 파장에서 standard 흡광도와 시료 흡광도를 측정한다.
b. 둘을 비교하여 단백질 양을 계산한다.

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